一、相关概念

菌落形成单位（Colony Forming Unit，CFU）：指在固体培养基上，由单个菌体或聚集成团的多个菌体生长繁殖形成的菌落。CFU是用于计算细菌或霉菌数量的单位，比直接计数更能反映活菌的数量。

菌落形成单位的计数方法包括平板计数法和倾注法。

平板计数法：将样品进行系列稀释后，取一定体积的稀释液涂布在琼脂平板上，培养一定时间后（通常为24~48小时），计数形成的菌落数。选择菌落数在30~300个之间的平板进行计数，计算公式为【CFU/mL=涂布体积（mL）平均菌落数*稀释倍数】

倾注法：将稀释后的样品与融化的琼脂培养基混合，倒入培养皿中，待凝固后进行培养。计数方法与平板计数法类似。

活菌数：指样品中能够在适宜条件下生长繁殖的活细菌数量。活菌数通常通过CFU来表示，因为CFU只计算能够形成菌落的活细菌。

活菌数测定方法包括直接计数法、比浊法、平板技术法和颜色改变单位法。

直接计数法：利用显微镜和计数板直接观察和计数细菌数量。这种方法简单快捷，但无法区分活菌和死菌。

比浊法：通过测量细菌悬液的浊度来估算细菌数量。常用的比浊法有麦氏比浊法和光电比浊法。比浊法适用于含有大量细菌的悬浮液，但无法区分活菌和死菌。

平板计数法：如前所述，通过CFU来测定活菌数。这种方法灵敏度高，是临床微生物检验中常用的活菌计数方法。

颜色改变单位法（CCU）：根据微生物在培养基中的代谢活力，通过培养基颜色的改变来计数微生物数量。此方法适用于一些特殊微生物，如支原体。

二、如何稀释

在进行菌落计数时，正确的稀释是很重要的。稀释样品的目的是确保每个培养皿中有适量的菌落形成单位，以便进行准确的计数。为了确定正确的稀释倍数，我们通常可以依据参考值来进行操作。

参考值可能是实验室经验累积的估算数，也可能是样品本身标注的活菌数值。对于有经验的操作者而言，即使没有明确的参考值，也能凭借经验准确进行稀释操作。然而，对于新手来说，缺乏参考值的情况下可能会感到迷茫。因此，建议在进行菌落计数时，首先尽可能获取参考值。根据参考值，可以选择适当的稀释倍数，然后将适量的样品与适量的培养基混合，并进行均匀涂布。如此一来，可以保证每个培养皿中的菌落数量在合适的范围内，从而得到准确可靠的结果。

三、技术技巧

1. 选择合适的稀释倍数和扩大计数范围

一种常见的策略是根据经验或参考值将样品稀释到一定倍数，然后在不同梯度上进行涂布。例如，稀释到10^-8的样品可以选择不同梯度的平板进行涂布，比如10^-8、10^-7、10^-6各三个平板。同时，也可以选择其他梯度如10^-9、10^-5、10^-4各一个平板，并留出一个对照平板。

通过采取这种策略，即使菌落数较低无法直接计数，也能通过扩大计数范围来获取参考值或估测值。在不同梯度的平板上观察和比对菌落的分布情况，可以为后续的活菌数估算提供帮助。这种方法可以帮助我们更全面地了解样品中的菌落密度，从而提高结果的准确性和可靠性。

2. 利用光学显微镜

一种常见的方法是将样品稀释到特定倍数（比如10^-8），然后采用单染色法，在显微镜下观察菌落情况。根据观察结果，我们可以做出以下处理：

①如果在显微镜下未观察到任何菌落，则可能需要增加稀释倍数，向前推进一个梯度，以便更清楚地观察到菌落。

②如果在显微镜下观察到1~5个菌落，则可以按照当前稀释倍数进行计数。这些菌落数量的范围通常相对较容易观察和计数。

③如果在显微镜下观察到超过5个菌落，就建议继续向前推进一个梯度进行更进一步的稀释。这样做可以确保每个培养皿中的菌落数量在适当的范围内，避免数量过多导致计数困难。

3. 利用血球计数板

常见的做法是将样品稀释到适当倍数（比如稀释到10^-8），然后使用血球计数板进行初步估算菌数。通过在血球计数板上直接观察并计数几个小方格中的菌落数量，我们可以快速地得到一个大致的菌数估计。

在使用血球计数板一次计数后，可以根据观察结果推算出整个液体中的菌落总数。通过这个估算值，我们可以初步判断是否符合实际菌落数的计数要求。如果初步估算的菌数与预期计数范围相符，则可以继续进行后续的菌落计数工作；若差距较大，则可能需要重新调整稀释倍数或采取其他措施以提高结果的准确性。

四、注意事项

1. 样品处理样品

①均质化：对于固体或半固体样品，使用均质器将样品均质化，以确保样品均匀分布。液体样品则需充分混匀。

②稀释液选择：通常使用无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水进行稀释，这些稀释液能更好地保护细菌并调节pH值。

2. 稀释操作

①稀释度选择：选择2~3个适宜的稀释度进行检测，确保最终的菌落数在可计数范围内（30~300CFU）。对于不常见的样品，可以适当延长稀释度至1:10000甚至更高。

②混匀:每次稀释后，确保样品均匀混合，可以使用振荡器进行混匀。

3. 培养基准备

①培养基温度：倾注培养基时，确保培养基温度适宜（约46℃），避免高温对微生物的杀伤作用。培养基过热或过冷都会影响细菌的生长。

②培养基量：倾注培养基的量一般为15毫升，过多或过少都会影响观察和计数。

4. 菌落计数

①计数工具：使用放大镜或菌落计数器可以提高计数的准确性。选择菌落数在30~300CFU之间的平板进行计数，并记录每个稀释度的平均菌落数。

②计数范围：对于低于30CFU的平板记录具体菌落数；高于300CFU的平板，记录为“多不可计”（TNTC）。

5. 结果计算

标准公式：严格按照标准公式计算菌落总数，并注意结果的修约。公式为【菌落数量（CFU/mL）=涂布体积（mL）平均菌落数*稀释倍数】

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